유전자 클로닝을 이용한 가축 매몰지 관측정, 침출수 및 주변 지하수의 세균 분석

1. 서 론

지난 2010년 경북 안동에서 구제역(Foot and mouth disease)이 발생된 후 2011년 4월 전국적으로 확산되면서 매몰지의 수가 약 4,600여개까지 증가하였으며(Central disaster and safety countermeasures headquaters, 2011), 이 후 농림수산식품부의 매몰지 사후관리 지침에 따라 이전 및 폐쇄 등으로 현재는 감소 추세이다. 그러나 매몰지에서 발생하는 침출수 및 사후관리로 인한 환경 및 인체 영향 등의 2차 피해에 대한 문제점은 지속적으로 제기되고 있다(Choi et al., 2013; Kawon et al., 2015). 이에 따라 매몰지 주변 지하수에 대하여 바이러스 및 병원성 세균 등이 조사되었고(Oh, 2012; Ahn, 2013; Kim et al., 2010), 환경부 국립환경과학원에서는 2011년부터 현재까지 전국적인 가축 매몰지 주변 지하수 종합조사(I-VI)를 통해 국가적 관리를 수행하고 있다.

그러나 가축매몰지역 환경조사 지침에 따르면, 매몰지 주변 150 m 이내 위치한 지하수 관정으로 제한을 두고 있어 상대적으로 관측정과 침출수에 대한 조사는 미흡하다. 또한 150 m 이내 주변 지하수 관정에서도 수온, pH, 전기전도도 및 용존산소 등의 기초 항목과 염소이온, 암모니아성 질소, 질산성 질소 등 이화학적 항목을 중심으로 운영되고 있어 미생물에 대한 조사는 오직 지표 미생물인 총대장균군 뿐이다.

이에 따라 매몰지 주변 미생물학적 영향에 대한 관리 지침의 필요성 이 제기되었고, 기초 조사로 국립환경과학원 가축 매몰지 주변 지하수 병원성 미생물 조사 연구(2011-2013)에서는 매몰지 주변 음용 및 비음용 지하수 약 3,500여개 시료에 대하여 Fecal coliform (검출율 14.6%), Escherichia coli (7.7%), Escherichia coli O157:H7 (미검출), Clostridium perfringens (0.8%), Salmonella spp. (0.3%), Shigella spp. (미검출), Norovirus (1.5%)및 Enterovirus (1.2%) 등에 대하여 조사하여 일반적인 축산 지역 주변의 음용 및 비음용 지하수 관정과 유사하게 분석된 바 있다. 또한 매몰지의 생물학적 안전성 확보를 위해 최근 Clostridium perfringens를 생물학적 안전성에 대한 지표미생물로 지정하여, 3년 경과 매몰지 사후관리 및 3년 이내 매몰지의 이설 등에 활용하고 있다.

한편, 지하수에서 미생물 유전자 다양성에 대한 연구는 amplified ribosomal DNA restriction analysis가 적용된 이 후(Kim et al., 2000), 비 배양 유전자 기반의 세균 군집 다양성 연구가 일부 적용되어 왔으나(Kim, 2006; Flynn et al., 2013; França et al., 2015), 가축 매몰지 주변 환경에서 비 배양 기반 유전적 접근은 미흡하며, 특히 매몰지 관측정 및 침출수에서 적용된 사례는 없었다. 따라서, 본 연구에서는 유전자 클로닝 방법을 이용하여 매몰지 관측정, 침출수 및 주변 지하수에 대한 세균 특성을 조사하였다.

2. 연구지역 및 방법

2.1 연구지역

수리지질학적 특성이 다른 연구 부지를 선정하여 관측정, 침출수, 그리고 주변 지하수의 미생물학적 특성을 비교하였다. 조사 지점으로는 평지에 위치한 D 매몰지와 산지에 위치한 Y 매몰지를 선정하였다. 두 매몰지는 모두 일반 매몰지로, 2011년 1월 구제역으로 D 매몰지는 약 1,500두 및 Y 매몰지는 약 4,800두의 돼지가 매몰되었다. 조사 시료는 두 매몰지 내부에 위치한 관측정(Y1, I107-1), Y 매몰지의 침출 수(Y2) 및 D 매몰지에서 약 100 M 지점에 위치한 지하수(BA-1)를 대상으로 시료를 채취하였다(그림 1).

Fig. 1.

The groundwater sampling wells in Y-burial site (a) and D-burial site (b).

3. 연구결과 및 토의

연구지역 침출수와 지하수 시료의 물리화학적 특성을 조사하기위해 다음과 같은 항목(Ca²⁺, Mg²⁺, Fe²⁺, Mn²⁺, Cl^-, NO₃^-, SO₄^-, HCO₃^-, NH₄⁺, DOC, T, pH, EC, DO)을 분석하였다. 산지에 위치한 Y 매몰지 지하수 시료는 EC, HCO₃^-, Cl^-, Ca²⁺, DOC 그리고 NH₄⁺ 항목에서 D 매몰지 지하수 시료보다 음양이온 성분이 높게 나타났다(Kaown et al., 2015). 침출수는 음양이온 중 HCO₃^-, Cl^-, NH₄⁺ 성분이 가장 우세하였다. 연구지역 지하수의 pH는 5.3~7.3 약산성에서 약알카리성을, 침출수의 경우 7.1 약알카리성을 나타내며, EC는 지하수의 경우 217~2,600 μS/cm, 침출수의 경우 4,677 μS/cm으로 나타나고 있다(Kaown et al., 2015).

관측정(Y1, I107-1) 40개 클론, 주변 지하수(BA-1) 20개 클론 및 침출수(Y2) 20개 클론 염기서열을 기반으로 동정을 수행하였다. Phylum 및 class-level 분석 결과, 매몰지 관측정에서는 β-Proteobacteria가 50.0%로 우점 하였고, δ-Proteobacteria 및 Bacteroidetes가 12.5%로 차우점하였다. 침출수에서는 α-Proteobacteria (35.0%)와 β-Proteobacteria (25.0%)가 높은 비율로 나타나 전체적으로 Proteobacteria가 70.0%로 우점 하였으며, Bacteroidetes가 15.0%로 나타났다. 주변 지하수에서는 δ-Proteobacteria가 40.0%로 우점 하였고, Bacteroidetes (20.0%), δ-Proteobacteria (15.0%) 순으로 나타났다. 또한 관측정에서는 타 시료에서 나타나지 않은 Firmicutes와 Elusimicrobia가 나타났고, 침출수에서는 γ-Proteobacteria, 주변 지하수에서는 Nitrospirae, Chloroflexi 및 Unknown proteobacteria가 특징적으로 나타났다. Phylum 및 classlevel에서는 관측정 및 주변 지하수에 비해 침출수에서 다양성이 떨어지고 우점도가 높아지는 경향성이 분석되었다(표 1). 이에 따라 관측정 및 주변지하수에 비해 침출수에서 미생물학적 오염이 상대적으로 높을 가능성이 예상되었다.

Table 1.

Comparison of the bacterial characteristics in monitoring-wells, leachate and surrounding groundwater near the animal carcass disposal sites at the phylum or class-level.

관측정, 침출수 및 주변 지하수에서는 모두 15~16개의 OTU가 분석되어 유사성 97.0% 기준에서는 유사한 다양성이 분석되었다. 시료에 따른 OTU 우점 분석 결과, D 관측정망에서는 OTU 01이 우점(20.0%), OTU 11이 차우점(10.0%) 하였으며, Y 관측정망에서는 OTU 03이 우점(15.0%), OTU 12가 차우점(10.0%) 하였다. 또한 침출수에서는 OTU 06, 07, 08 및 09가 각각 10.0%로 공동 우점 하였으며, 주변 지하수에서는 OTU 02가 20.0%로 우점, OTU 04가 10.0%로 차우점하였다(data not shown). 계통수를 통해 분석한 결과, 관측정망에서 우점 또는 차우점한 4개의 OTU (01, 03, 11 및 12)는 Candidatus Planktophila limnetica, Brevibacillus levickii, Sulfuricella denitrificans 및 Sideroxydans lithotrophicus cluster로 나타났고, 침출수에서 공동 우점한 4개의 OTU는 Flavobacterium sasangense, unclassified (phylum-level), Curvibacter fontanus 및 α-proteobacteria로 분류되는 새로운 cluster로 나타났으며, 주변 지하수에서 우점 및 차우점한 OTU 02 및 04는 Propionivibrio dicarboxylicus와 Sediminibacterium goheungense cluster로 분석되었다(그림 2).

Fig. 2.

Phylogenetic tree of the 16S rRNA gnene sequences of eighty clones from monitoring-wells, leachate and surrounding groundwater. A neighbor-joining tree was reconstructed with the Kimura two-parameter in MEGA 5. Kingdom archaea used as an out-group. Bootstrap values less than 50% based on 1,000 replications are shown. Bar, 0.05 nucleotide substitutions per nucleotide position.

침출수에서 특징적으로 나타난 α- 및 γ-Proteobacteria는 Acidisphaera rubrifaciens, Ferrovibrio sp., Sphingomonas sediminicola, Asticcacaulis benevestitus, Prosthecomicrobium enhydrum, Devosia insulae, unknown α-proteobacteria cluster, Arenimonas maotaiensis 및 unkown γ-proteobacteria cluster였다(그림 2). Acidisphaera속은 오직 1종으로 호기적 조건에서 성장하며 세균 엽록소를 포함하고 있으며 산성 환경에서 분리된 바 있다(Hiraishi et al., 2000). Ferrovibrio속은 통성혐기성으로 Fe(II)를 산화하며, F. denitrificans 한 종으로 구성 된다(Sorokina et al., 2012). Sphingomonas속은 약 100여종으로 구성되며, 다양한 환경 중 서식하는 것이 보고되어 있다. 특히 매몰지와 관련 없는 지하수에서도 보고된 바 있으며(França et al., 2015), Sphingobium, Sphingopyxis, Novosphingobium, Porphyrobacter 및 Rhizorhabdus속 등 다수의 Sphingomonadaceae가 지하수 중 서식이 보고되었다(Lee et al., 2015). Asticcacaulis 속은 총 5종으로 구성되며, 동토대 습지 토양, 큰뱀무 뿌리, 산림 흙 및 호수 등에서 보고된 바 있다[List of prokaryotic names with standing in nomenclature (LPSN), 2016a]. Prosthecomicrobium 속은 총 6종으로 구성되며, 바다, 토양 등 환경에 존재하며 cellulose를 분해할 수 있는 것으로 보고되었다(LPSN, 2016b). Devosia속은 총 16종으로 구성되고, 심해 및 해변 저질토, diesel-contaminated, 살충제를 버린 토양 등 주로 토양에서 서식하며, hexachlorocyclohexane dump site, 의료거머리 및 수생콩과식물 등에서도 보고된 바 있으며, 일부 질소고정 기능이 알려져 있다(LPSN, 2016c). 또한 Arenimonas 속은 9종으로 구성되며, 퇴비, 토양, 민물 등 환경 중 넓은 서식 범위가 알려져 있는 등(LPSN, 2016d), 침출수에서만 나타난 특이적 세균은 대부분 환경 중 서식이 가능한 것으로 추정되며, 매몰지와의 연관성은 나타나지 않았다. 또한 침출수에서 나타나지 않은 δ-Proteobacteria와 Spirochaetes는 세부적으로 Bdellovibrio, Hyalangium, unknown δ-Proteobacteria cluster 및 unknown spirochaetes cluster로 분석되었다(그림 2).

한편, D 매몰지 주변의 관측정 및 주변 지하수에서 OTU 04와 10이 공통적으로 나타났다. OTU 04는 Sediminibacterium goheungense cluster로, Sediminibacterium속은 부영양 저질토에서 S. salmoneum이 최초 보고 후(Kim et al., 2013), S. ginsengisoli와 S. goheungense가 인삼밭 토양 및 민물호수에서 추가 보고되어(Kojima and Fukui, 2011; Kang et al., 2014) 현재까지 총 3종이 포함된다. Sediminibacterium속은 현재까지 토양과 호수 등 일반 자연환경에서도 존재할 가능성이 있어 매몰지와의 큰 상관성 알 수 없으나, gentamicin과 kanamycin 등 항생제 내성이 있는 것으로 보고된 바 있어(Kang et al., 2014), 가축 사료 또는 비료 등과 관련성이 예상된다. OTU 10은 Sulfurisoma sediminicola cluster로, Sulfurisoma속은 민물 호수에서 분리된 오직 S. hydrogenivorans 한 종만이 보고되고 있으며(Kojima and Fukui, 2011), 이들은 통성혐기성으로 무기독립영양 또는 종속영양을 하는 것으로 알려져 있다. 또한 다른 모든 시료에서는 공통된 OTU가 분석되지 않았고, 총 80개 클론에서 61개 OTU가 분석되었다.

4. 결 론

이번 연구에서는 유전자 클로닝을 기반으로 매몰지 관측정, 침출수 및 주변 지하수의 세균 특성을 분석하였다. 특히 침출수는 phylum-level의 다양성에서 다양성이 줄고 우점도가 높아지는 경향성이 분석되었는데, 이것은 관측정과 주변 지하수에 비해 상대적으로 미생물학적 오염 정도가 높은 것으로 나타날 수 있으나, 침출과정 중 주변 토양 등 타 환경에 의한 영향의 가능성을 고려할 필요성이 있다. 또한 본 연구에서 수행한 클로닝 기반의 OTU 분석은 염기서열 수에 제한으로 어려움이 있었으나, next generation sequencing 등 metagenomics를 이용한 비배양성 기반의 microbial source tracking으로 매몰지 주변 미생물학적 환경 영향 평가에 대한 연구적 접근은 가능할 것으로 예상된다. 따라서 이번 연구의 방법적 접근과 결과는 향후 매몰지 주변 지하수 등 수계 환경 중 미생물학적 환경 영향을 연구하는데 기초 자료로 활용 할 수 있을 것이라고 기대된다.

Acknowledgments

이 논문은 2015년도 정부(미래창조과학부)의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 연구(No. 0409-20150163)입니다.

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